Soubor obsahuje výpisky z přednášek a cvičení z Genových technologií na ČZU.

"Genové technologie
- genové technologie:
• cílem je detekce genetické variability
- na začátku byli všichni homozygoti => mutace a vznikl heterozygot
- SNP = bodové mutace, vytvořily se v průběhu evoluce
- genové technologie vymýšlejí metody, jak takovéto mutace detekovat
- mutace - mohou vézt ke změnám pořadí AMK => změna funkce proteinu => funkce organismu
- využití detekce mutací => diagnostika
- kandidátní geny - asociace mezi genetickou variací v předem specifikovaných zájmových genech a
fenotypy nebo chorobnými stavy
- kauzální mutace - mutace jednoho proteinu ovlivní deficienci jiného proteinu => projev choroby
- HZ využití pro selekce chovných zvířat, u Ho prenatální diagnostika
- forenzní genetika/analýzy - na základě specifických sekvencí se identifikuje (př. kriminalistika,
archeologie), rodičovské testy
• jak je možné genetickou variabilitu měnit
- mutacemi - vytvoří se nové geny
- křížením - nezískají se nové geny jako takové, ale v důsledku crossing-overu se mění kombinace
genů, využití ve šlechtění
- editace genomu - upravují se geny, geny se vypínají
- etika - jestli má člověk právo s genomem si pohrávat
Enzymy syntetizující nukleové kyseliny
- genové technologie využívají enzymy, který dokážou zpracovávat molekuly související s genetikou =>
enzymy, co něco provádí s DNA/RNA nebo s proteiny
- enzymy - snižují aktivační E
- jde o protein, může mít i neBK složku
- zapojují se do syntézy NK - součástí replikačního aparátu a transkripce
- polymerizace - opakování jednoduchých stavebních jednotek => platí i pro DNA/RNA
- polymerázy - spojují nukleotidy => tvorba fosfodiesterové vazby
- fosfodiesterové vazby - je to silná kovalentní vazba, pro vznik této vazby je zapotřebí enzymů a ATP
- rozdělení enzymů využívaných v genových technologiích
1. enzymy syntetizující NK - tyto enzymy zle kategorizovat na:
a) DNA polymerázy závislé na DNA - syntéza nového vlákna podle templátového vlákna DNA
na principu komplementarity
• DNA polymeráza I - holoenzym
• Klenowův fragment
• T4 DNA polymeráza
• T7 DNA polymeráza
• Taq DNA polymeráza
• Tli DNA polymeráza
• DNA polymerýzy z rodu Pyrococcus (Pfu, Pwo, Deep Went)
• Tht DNA polymeráza
b) DNA polymerázy závislé na RNA - syntéza nového vlákna DNA na základě vlákna RNA =
enzym reverzní transkriptázy (vlastní př. virus HIV)
c) netemplátové DNA polymerázy - př. telomerázy (přidávají netemplátové nukleotidy na
vlákno)
d) RNA polymerázy závislé na DNA - syntéza nového vlákna RNA na základě vlákna DNA =
transkripce
e) RNA polymerázy závislé na RNA - syntéza nového vlákna RNA na základě vlákna RNA = př.
RNA viry, viroidy
f) netemplátové RNA polymerázy - př. polyadenylace
2. enzymy štěpící NK
3. enzymy modifikující NK
OBECNÝ POHLED NA DNA POLYMERÁZY
- 1. objevy týkajících se DNA polymeráz byly provedeny u prokaryotních org. - u bakterie Escherichia coli
- funkce DNA polymeráz byla v obecné podobě vysvětlena v rámci předmětu Obecná mlk biologie
- E. coli - gramnegativní tyčinkovitá bakterie
- všudypřítomná střevní bakterie, stávala se modelem pro genové technologie
- v evropské populaci docházelo k otravě kvůli pozření E.coli, ale z jiného kmenu => horečky,
sepse, otravy krve => obtížně léčitelná, byla rezistentní vůči ATB
- jako model se využívají „bezpečné kmeny“
- bakteriofágové - viry, predátoři bakterií, díky ním existují „bezpečné“ kmeny
- bezpečné kmeny bakterií - nejsou schopny se bránit virům, tyto se využívají v laboratořích
- prvoci - někteří se živí také bakteriemi, i př. háďátka
- je známá sekvence jejího genomu - 4,7 milionů párů bazí, 3 500 genů
- genom je tvořen ds kružnicovitou mlk DNA
- obsahuje plazmidy = malé cirkulární mlk kružnicovité ds DNA
OBJEV PRINCIPU REPLIKACE DNA
- A. Kornberg poprvé charakterizoval v 50. letech minulého století, že nové řetězce DNA při replikaci u E.
Coli vznikají z dNTP (= deoxynukleoside triphosphate)
- popsal energetický mech. této reakce
- pracoval s radioaktivně značeným fosfátem v dNTP a sledoval jeho inkomporaci do nově vznikajících
vláken DNA
- získal enzym, který tuto reakci katalyzuje - tento enzym byl nazván DNA polymeráza I
- v roce 1959 získal Nobelovu cenu (popsal, jakým principem funguje DNA polymeráza)
- jak na to přišel:
• DNA je tvořena 2 vlákny
• DNA se bude replikovat => původní 2 vlákna se od sebe oddělují a díky enzymu se vytvoří
komplementární vlákna
• K. před 1. vlnou replikace u E. coli přidal do kultivačního média radioaktivně značený nukleotid
• DNA poly. začala radioaktivně značené nukeotidy polymerizovat a začala vytvářet komplementární
řetězec
• po replikaci budou buňky vydávat radioaktivní signál (nukleotidy se zabudovaly)
• proběhne 2. vlna replikace => radioaktivita se zvětší, v další
vlně taky atd.
• na základě vzrůstající radioaktivity zjistil, že DNA
polymeráza zabudovává radioaktivní nukleotidy => 1
vlákno staré, jedno nové = semikonzervativnost
• pojmenoval DNA polymerázu 1 - 1. DNA polymeráza, která
byla popsaná a chemicky vyizolovaná
• prokázal, že DNA polymeráza pracuje i ve zkumavce
- dNTP - ty potřebuje DNA polymeráza, jsou 4 typy, liší se
nukleotidem (bází)
- směs dNTP = směs těchto 4 nukleotidů
- na C3 je volná hydroxylová skupina
- na C1 je navázaný nukleotid
- na C5 je navázaný fosfát
- DNA polymeráza vždy potřebuje trifosfáty, nedokáže
polymerizovat př. monofosfát
- z trifosfátu se do kostry zabudovává jen 1 fosfát, který je nejbližší heterocyklu (cukru) = alfafosfát
(součástí fosfodiestrerové vazby)
- ostatní fosfátové skupiny se odštěpí ve formě difosfátu
DALŠÍ OBJEVY SPOJENÉ SE SYNTÉZOU
- S. Ochoa - významný biochemik, který se věnoval zejména energetickým procesům spojených s replikací
DNA a tvorbou RNA
- dále studoval oxidativní fosforylaci (zisk E v mitochondriích), metabolismus MK, utilizaci CO2
(zabudování do složitější molekuly organického charakteru - fotosyntéza), biologickou funkci
vit. B1, fotosyntézu, enzymy Krebsova cyklu, …
- potvrdil funkci genetického kódu
- nositel Nobelovy ceny
PODMÍNKY NUTNÉ PRO FUNKCI DN"

PRÁCE BYLA UVOLNĚNA BEZ NÁROKU NA HONORÁŘ