Seminarky.cz > Diplomky, bakalářky > Bakalářské práce > > Metody laboratorní diagnostiky klíšťové encefalitidy - bakalářská práce

Metody laboratorní diagnostiky klíšťové encefalitidy - bakalářská práce

Kategorie: Medicína

Typ práce: Bakalářské práce

Škola: nezadáno/škola není v seznamu

Charakteristika: Tato experimentální bakalářská práce představuje metody laboratorní diagnostiky klíšťové encefalitidy. V teoretické části popisuje virus klíšťové encefalitidy, včetně diagnostiky. Informuje o materiálech a metodách přípravy templátu. Dále seznamuje s výsledky.

Obsah

1.
Úvod
2.
Teoretická část
2.1
Virus klíšťové encefalitidy
2.2
Diagnostika klíšťové encefalitidy
3.
Materiál a metody
3.1.
Virus
3.2.
Metody přípravy templátu pro RT-PCR a real-time PCR
3.2.1.
Purifikace virové RNA pomocí kitu QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)
3.2.2.
Purifikace virové RNA pomocí kitu RTP® DNA/RNA Virus Mini kit (Invitek)
3.2.3
Izolace RNA pomocí fenol – chloroformové metody – TRI REAGENT TM (Sigma Aldrich)
3.2.4.
Opracování vzorku pomocí chelexu
3.3.
Dvoukroková RT-PCR 12
3.3.1.
Reverzní transkripce (RT)
3.3.2.
PCR
3.4.
Real- time RT-PCR
4.
Výsledky
4.1.
Optimalizace protokolu pro opracování vzorku pomocí Chelex® 100 Resin (BioRad)
4.2.
Porovnání jednotlivých metod opracování vzorku
5.
Diskuze
6.
Závěr

Úryvek

"3.2. Metody přípravy templátu pro RT-PCR a real-time PCR

3.2.1. Purifikace virové RNA pomocí kitu QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)

Izolace byla provedena přesně podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze (modelový vzorek, 3,3x107 PFU/ml) bylo v mikrozkumavce smícháno s AVL pufrem obsahující RNA carrier, který zajistí adsorbci virové RNA na speciální silikagelovou membránu v kolonce. Poté následuje vymývání kontaminant pomocí dvou různých pufrů AW1 a AW2. Nakonec byla virová RNA eluována z kolonky pomocí 60 µl elučního pufru AVE (RNaze free) do mikrozkumavky a následně uložena do -70 °C.


3.2.2. Purifikace virové RNA pomocí kitu RTP® DNA/RNA Virus Mini kit (Invitek)

Izolace byla provedena přesně podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze byla v mikrozkumavce smícháno s vázacím roztokem. Poté byl vzorek vymýván pufry R1 a R2 a následně byla virová RNA eluována do sterilní mikrozkumavky pomocí 60 µl elučního pufru R. Mikrozkumavka s izolovanou RNA byla uložena do – 70 °C.

3.2.3 Izolace RNA pomocí fenol – chloroformové metody – TRI REAGENT TM (Sigma Aldrich)

Izolace byla provedena podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze bylo smícháno s TRI REAGENT (jedná se o komerčně dostupný roztok složený z denaturačního pufru – obsahující guanin thyokyanát a fenol). Následně byl přidán chloroform a centrifugací 15min při 12 000 x g se suspenze rozdělila na tři fáze. Horní vodní bezbarvá fáze obsahovala RNA, která byla odsáta do nové mikrozkumavky a precipitována pomocí isopropanolu. Poté byl vzorek opakovaně promýván ethanolem, vysušen na vzduchu, rozpuštěn v 50 µl vody a následně uchován v -70 °C.

3.2.4. Opracování vzorku pomocí chelexu

Pro opracování vzorku byl použit pufr Chelex (BioRad Chelex® 100 Resin). Pufr sám o sobě nepurifikuje virovou RNA, ale vytváří komplexy s nežádoucími inhibitory PCR reakce.
Byl použit 5% roztok Chelexu v TE pufru ( 5g Chelexu rozpustit v 95 ml TE pufru pH 8,0 [10mM Tris.Cl, pH 8,0 a 1 mM EDTA, pH 8,0]). Vzniklý roztok byl přidán do 1,5 ml mikrozkumavek s mozkovou suspenzí – pro optimalizaci protokolu bylo zvoleno množství 25 µl a 50 µl chelexového roztoku / 20 µl mozkové suspenze. Následně byly vzorky inkubovány po dobu 2, 3, 4 hodin při 56 °C. Poté byly vzorky promíchány vortexováním a následně inkubovány 15 min při 70 °C. Vzorky byly dále krátce centrifugovány a vzniklý supernantant byl uložen do – 70 °C pro další použití pro RT-PCR. "

Poznámka

Čistý text dosahuje 13,5 strany. Práce obsahuje tabulky a grafy.
Jedná se o experimentální bakalářskou práci

Vlastnosti

STÁHNOUT PRÁCI

  1. SMS platba (ČR) 15 Kč

    Platba prostřednictvím brány mobilního operátora. Pro započetí platebního procesu prosím vyplňte kontrolní kód a stiskněte tlačítko "Zaplatit"

    Po proběhnutí platby budete přesměrováni zpět na tuto stránku, kde najdete odkaz ke stažení práce.


    V případě potíží s realizací platby se neváhejte obrátit na infolinku poskytovatele služby, společnost Advanced Telecom Services s.r.o., na čísle +420 776 999 199

    Nápověda pro zákazníky Telefónica O2:

    1. Vyplňte Vaše číslo na mobil, zvolte jako operátora Telefónica O2 a klikněte na POTVRDIT.
    2. Zobrazí se Vám informace, že SMS byla odeslána.
    3. Na mobilní telefon Vám bude doručena SMS zpráva s odkazem.
    4. Klikněte na odkaz v SMS zprávě, budete propojeni na platební bránu společnosti Telefónica O2. Zde potvrďte platbu.
    5. Na internetu se zobrazí výsledek proběhlé platby.
    Pro úspěšnou realizaci platby je nutné mít aktivní službu „O2 platba“. Služba je většinou aktivní automaticky, takže není třeba nejdřív nic aktivovat.

    Nápověda pro zákazníky Vodafone:

    1. Vyplňte Vaše číslo na mobil, zvolte jako operátora Vodafone a klikněte na POTVRDIT.
    2. Dojde k přesměrování na Vodafone portál.
    3. Potvrďte Vaše mobilní číslo kliknutím na DALŠÍ. .
    4. Na Váš mobilní telefon přijde SMS zpráva s kódem.
    5. Zadejte tento kód do formuláře, klikněte na OK.
    6. Objeví se Vám údaje o platbě, kterou potvrďte kliknutím na POKRAČOVAT.
    7. V té chvíli proběhne platba, o jejímž výsledku Vás informuje došlá SMS zpráva.
    Pro úspěšnou realizaci platby je nutné mít aktivní službu „M-peněženka“. Služba je většinou aktivní automaticky, takže není třeba nejdřív nic aktivovat.

    Nápověda pro zákazníky T-mobile:

    1. Vyplňte Vaše číslo na mobil, zvolte jako operátora T-mobile a klikněte na POTVRDIT.
    2. Dojde k přesměrování na T-mobile portál, potvrďte zde svůj souhlas s podmínkami platby.
    3. Pokud máte na T-zones účet, přihlaste se a pokračujte bodem 7.
    4. Pokud účet na T-zones nemáte, vepište do formuláře svoje mobilní číslo a klikněte na ODESLAT ČÍSLO.
    5. Přijde Vám SMS zpráva s kódem.
    6. Vepište kód jako heslo do formuláře a klikněte na PŘIHLÁSIT.
    7. Objeví se Vám údaje o platbě, které potvrďte kliknutím na tlačítko ZAPLATIT.
    8. V té chvíli proběhne platba, o jejímž výsledku Vás informuje došlá SMS zpráva.
    Pro úspěšnou realizaci platby je nutné mít aktivní službu „M-platba“. Služba je většinou aktivní automaticky, takže není třeba nejdřív nic aktivovat.
  2. Platit kartou 15 Kč

    Platba kartou. Pro započetí platebního procesu prosím vyplňte kontrolní kód a stiskněte tlačítko "Zaplatit"

    Po proběhnutí platby budete přesměrováni zpět na tuto stránku, kde najdete odkaz ke stažení práce.


    Po odeslání kontrolního kódu budete přesměrováni do platební brány GP webpay, kde zadáte údaje potřebné pro platbu. Platbu dokončíte stisknutím tlačítka "ZAPLATIT".

    Akceptované karty: VISA, VISA Electron, V PAY, MasterCard, Maestro.

  3. Koupit za kredity - 10 Kč >>> ZVÝHODNĚNÁ CENA!
    Jedním stiskem tlačítka, obratem a za výhodnou cenu!
    JEN PRO REGISTROVANÉ UŽIVATELE
    Cena za stažení je pouze 180 kreditů (=10Kč).
  4. Platit převodem z ČSOB a Poštovní spořitelny, službou PaySec 10 Kč >>> ZVÝHODNĚNÁ CENA!
    Rychle, bezpečně a pohodlně.
    Zaplatit za tuto práci přes PaySec >>> Kliknutí na odkaz Vás přesměruje do platebního rozhraní
    Kliknutím na ikonku Vás přesměrujeme do platebního systému, kde si vyberete převod z ČSOB, Poštovní spořitelny nebo platbu PaySec
  5. SMS platba (Slovensko) - 0,60€
    Stahovací kód k této práci získáte do několika minut se službou mobilního operátora Premium Rate SMS.
    Zašlete SMS zprávu ve tvaru: SEMmezera17388
    - na telefonní číslo: 8877
    Cena jedné SMS je 0,60€ včetně DPH. Pro využití SMS platby je třeba mít aktivovanou službu Premium Rate SMS. Službu technicky zajišťuje Advanced Telecom Services, s. r. o.
    SMS musí být ve formátu TEXT, bez diakritiky a bez formátování (tj. základní velikost a typ písma). Stahovací kód je použitelný pouze pro tuto práci a je platný až do uzavření okna internetového prohlížeče.
    Stahovací kód přijde obratem na mobil, je platný 24 hodin a lze jej zadat celkem dvakrát.
    Pro stažení této práce zadejte stahovací kód (bez uvozovek):


Důležité informace: Provedením mobilní platby, odesláním SMS, platbou kredity, platbou kartou, PaySecem nebo převodem z účtu souhlasíte s Podmínkami stahování.
Veškeré informace o platbách si můžete přečíst zde.
Máte při placení nebo stahování práce problém? Odpovědi na časté problémy najdete zde nebo kontaktujte naší podporu.

Diskuse