1.

Úvod

2.	Teoretická část

2.1	Virus klíšťové encefalitidy

2.2	Diagnostika klíšťové encefalitidy

3.	Materiál a metody

3.1.

Virus

3.2.	Metody přípravy templátu pro RT-PCR a real-time PCR

3.2.1.

Purifikace virové RNA pomocí kitu QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)

3.2.2.

Purifikace virové RNA pomocí kitu RTP® DNA/RNA Virus Mini kit (Invitek)

3.2.3

Izolace RNA pomocí fenol – chloroformové metody – TRI REAGENT TM (Sigma Aldrich)

3.2.4.

Opracování vzorku pomocí chelexu

3.3.	Dvoukroková RT-PCR 12

3.3.1.

Reverzní transkripce (RT)

3.3.2.

PCR

3.4.	Real- time RT-PCR

4.

Výsledky

4.1.	Optimalizace protokolu pro opracování vzorku pomocí Chelex® 100 Resin (BioRad)

4.2.	Porovnání jednotlivých metod opracování vzorku

5.

Diskuze

6.

Závěr

"3.2. Metody přípravy templátu pro RT-PCR a real-time PCR

3.2.1. Purifikace virové RNA pomocí kitu QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)

Izolace byla provedena přesně podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze (modelový vzorek, 3,3x107 PFU/ml) bylo v mikrozkumavce smícháno s AVL pufrem obsahující RNA carrier, který zajistí adsorbci virové RNA na speciální silikagelovou membránu v kolonce. Poté následuje vymývání kontaminant pomocí dvou různých pufrů AW1 a AW2. Nakonec byla virová RNA eluována z kolonky pomocí 60 µl elučního pufru AVE (RNaze free) do mikrozkumavky a následně uložena do -70 °C.


3.2.2. Purifikace virové RNA pomocí kitu RTP® DNA/RNA Virus Mini kit (Invitek)

Izolace byla provedena přesně podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze byla v mikrozkumavce smícháno s vázacím roztokem. Poté byl vzorek vymýván pufry R1 a R2 a následně byla virová RNA eluována do sterilní mikrozkumavky pomocí 60 µl elučního pufru R. Mikrozkumavka s izolovanou RNA byla uložena do – 70 °C.

3.2.3 Izolace RNA pomocí fenol – chloroformové metody – TRI REAGENT TM (Sigma Aldrich)

Izolace byla provedena podle firemního protokolu. 20 µl infikované mozkové suspenze bylo smícháno s TRI REAGENT (jedná se o komerčně dostupný roztok složený z denaturačního pufru – obsahující guanin thyokyanát a fenol). Následně byl přidán chloroform a centrifugací 15min při 12 000 x g se suspenze rozdělila na tři fáze. Horní vodní bezbarvá fáze obsahovala RNA, která byla odsáta do nové mikrozkumavky a precipitována pomocí isopropanolu. Poté byl vzorek opakovaně promýván ethanolem, vysušen na vzduchu, rozpuštěn v 50 µl vody a následně uchován v -70 °C.

3.2.4. Opracování vzorku pomocí chelexu

Pro opracování vzorku byl použit pufr Chelex (BioRad Chelex® 100 Resin). Pufr sám o sobě nepurifikuje virovou RNA, ale vytváří komplexy s nežádoucími inhibitory PCR reakce.
Byl použit 5% roztok Chelexu v TE pufru ( 5g Chelexu rozpustit v 95 ml TE pufru pH 8,0 [10mM Tris.Cl, pH 8,0 a 1 mM EDTA, pH 8,0]). Vzniklý roztok byl přidán do 1,5 ml mikrozkumavek s mozkovou suspenzí – pro optimalizaci protokolu bylo zvoleno množství 25 µl a 50 µl chelexového roztoku / 20 µl mozkové suspenze. Následně byly vzorky inkubovány po dobu 2, 3, 4 hodin při 56 °C. Poté byly vzorky promíchány vortexováním a následně inkubovány 15 min při 70 °C. Vzorky byly dále krátce centrifugovány a vzniklý supernantant byl uložen do – 70 °C pro další použití pro RT-PCR. "

Čistý text dosahuje 13,5 strany. Práce obsahuje tabulky a grafy.
Jedná se o experimentální bakalářskou práci