1.

Úvod

1.1	Kathepsin, prokathepsin D: rakovinný marker

1.1.1

Struktura kathepsinu D

1.1.2

Prokathepsin D: Biosyntéza, struktura a aktivace

1.1.3

Transport kathepsinu D

1.1.4

Substrátová specifita a katalytický mechanismus kathepsinu D

1.1.5

Fyziologické funkce kathepsinu D v organismu

1.1.6

Kathepsin D: zvýšená koncentrace u nádorových onemocnění

1.1.7

Transport kathepsinu D u nádorových buněk

1.1.8

Kathepsin D: využití v diagnostice nádorových onemocnění

1.1.9

Kathepsin D: zvýšená sekrece v keratinocytech

1.1.10

Úloha kathepsinu D v chemoresistenci

1.1.11

Shrnutí

2.	Experimentální část

2.1	Materiály a přístroje

2.1.1

Chemikálie

2.1.2

Přístroje a materiál

2.1.3

Lidská séra

2.2

Metody

2.2.1

Uchovávání lidských sér

2.2.2

Nepřímá nekompetitivní ELISA

2.2.3

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu SDS – PAGE

2.2.4

Western blot

2.2.5

Příprava polyklonálních protilátek proti MAP

2.2.6

Izolace králičích polyklonálních protilátek proti MAP z králičího séra

3.

Výsledky

3.1	Příprava polyklonnálních protilátek proti lidskému prokathepsinu D a jejich charakterizace

3.1.1

Imunizace a izolace IgG

3.1.2

Afinitní chromatografie

3.2

ELISA

3.2.1

Kompetice králičích protilátek a MAP

3.2.2

Kompetice izolovaných králičích protilátek s protilátkami proti pCD u pacientů s onkologickým onemocněním

3.2.3

Stanovení hladiny protilátek proti pCD u kontrolní skupiny zdravých dárců

3.2.4

Stanovení hladiny protilátek proti pCD u pacientů s onkologickým onemocněním

3.2.5

Výsledek lyzátu Olomouc

4.

Diskuse

"1. Úvod
Na základě výzkumů jsou mutace některých genů spojovány s rozvojem rakoviny. Jedná se především o tzv. tumor - asociované geny, které jsou zkoumány imunohistochemickými a molekulárními analýzami jako možné budoucí diagnostické, prognostické a terapeutické markery.

Her-2 gen
Gen pro Her-2 je v současnosti stanovován především za účelem výběru pacientů s ranou nebo pokročilou rakovinou prsu, které je možné léčit Trastuzumabem, popř. sledování účinnosti léčby tímto cytostatikem51. Spolu s dalšími faktory může Her-2 sloužit i ke stanovení prognózy onemocnění. Prozatím ale nebyla předložena přesvědčivá data, na základě kterých by bylo vhodné doporučit Her-2 jako vhodný faktor pro předpověď odpovědi na léčbu i u jiných druhů adjuvantích chemoterapií. Her-2 prozatím nepatří mezi rutinně stanovované markery52. Stanovení Her-2 se provádí imunohistochemickou analýzou nebo pomocí FISH (fluorescenční in situ hybridizace)53,54

BRCA 1 a 2
Nejvíce stanovovanými geny u pacientů s rodinou anamnézou několikanásobného výskytu karcinomu prsu nebo vaječníků jsou BRCA 1 a 2. BRCA 1 se nalézá na 17 chromozomu55 a BRCA 2 na 13 chromozomu56. Testování výskytu mutace v genech BRCA 1 a 2 se provádí především v rámci screeningu pacientů s vysokým rizikem rozvoje rakoviny prsu a vaječníků5.
1.1 Kathepsin, prokathepsin D - rakovinný marker
Různé skupiny proteáz, např. serinové proteázy (uPA)1, metalloproteinázy2, cysteinové kathepsiny (kathepsin B a L)3 a aspartátový kathepsin D (CD)4 jsou spojovány s procesy souvisejícími s rakovinným bujením jako např. proliferace, invazivnost nebo tvorba metastáz.

1.1.1 Struktura kathepsinu D
Kathepsiny patří mezi nejvíce studované hydrolázy, které degradují proteiny v kyselém pH v lysozomech. Kathepsiny se dělí do 3 skupin podle aminokyseliny přítomné v jejich aktivním místě - cysteinové ( kathepsiny B, C, H, F, K, L), aspartátové (D a E) a serinové (G)4. Jako kathepsiny byly poprvé označeny R. Willstätterem a E. Bamannem kyselé proteázy nalezené ve vodných extraktech živočišných tkání57. CD byl studován u mnoha různých druhů živočichů, včetně prasat58, myší59, kuřat60, komárů61 a jiných.
Kathepsin D (E.C. 3.4.23.5) je aspartátová endoproteáza, která se nalézá v lysozomech buněk18. Gen lidského CD obsahuje 9 exonů a je lokalizován na chromosomu 11p15, přepisem tohoto genu vzniká jednoduchý transkript o velikosti 2,2 kb62. Exprese CD je regulována steroidními hormony, růstovými faktory IGF-1, TNF-α a EGF63. Struktura CD, stejně jako dalších aspartátových proteáz (renin, chymosin, pepsinogen), je tvořena dvěma laloky. Krystalická struktura nativní formy lidského zralého CD vykazuje vysoký stupeň podobnosti v terciární struktuře s ostatními členy skupiny aspartátových proteáz. Aktivní místo CD obsahuje 2 aktivní zbytky aspartátu (aminokyselina 33 a 231) lokalizované na 14 kDa a 34 kDa řetězci."

Práce není dokončená.
Součástí práce jsou grafy, tabulky, schémata či vzorce, rozsah čistého textu činí cca 22 stran.